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试管婴儿人类冷冻精液质量专家共识

日期:2021-09-06   浏览次数:

                                               试管婴儿人类冷冻精液质量专家共识

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这一共识集中在人类冷冻精液的质量和安全性上。由中国妇幼保健协会辅助生殖技术监测与评价专业委员会精子库与生殖男科发起。组织国内人类精子库领域专家成立专家共识工作组,然后反复讨论撰写。内容包括与人类冷冻精液质量相关的5个方面16点,包括实验室环境设置、降低供精者病原微生物感染风险、保证冷冻精液标本质量、保证冷冻精液标本保存安全、加强精子使用随访试管婴儿助孕

人类精子库是以治疗不孕症、预防遗传病、提供生育保险为目的,利用超低温冷冻技术采集、检测、保存和提供精子,为国内经卫生行政部门批准开展人类辅助生殖技术的医疗机构提供相关技术服务的机构。1981年,中国第一个人类精子库在湖南长沙建立。此后,国内人类精子库相继建立。截至2020年底,全国卫生健康委员会批准的人类精子库共有27家。国内精子供应市场需求巨大。2017年,我国辅助生殖技术用于供精累计应用超过2.5万个周期。国内所有人类精子库均按照原卫生部2003年颁布的《人类精子库基本标准和技术规范》对捐精者进行初筛、实验室检查、保存、外供和后续管理。

人类精子库的重要任务之一是为有资质的辅助生殖医疗机构提供健康合格的冷冻精液标本。因此,保证体外冷冻精液的质量和安全是人类精子库最重要的核心任务之一,包括实验室环境安全、精液标本的生物安全、冷冻精液标本的质量、标本的储存安全和供体精液标本的使用安全五个方面。我国精子库数量逐渐增多,卫生行政部门尚未发布人类精子库外供应精液的质量安全服务标准。如何保证冷冻精液标本的安全性,标准不一,实际工作中遇到的问题也难以达成共识。

为此,为确保供精标本质量安全,规范精子库供精标本管理,中国妇幼保健协会辅助生殖技术监测与评价专业委员会委托精子库和生殖男科团队组织专家成立共识讨论组(以下简称共识讨论组)。针对临床实践中遇到的诸多具体问题,通过前期问题收集、文献总结和多次专家讨论,达成共识,为保障人类精子库冷冻精液质量安全提供参考。

2号

方法

该共识收集了中国人类精子库冷冻精液的相关安全问题。共识讨论专家组以循证医学证据和临床经验为基础,在原卫生部2003年发布的《人类精子库基本标准和技术规范》的基础上,通过问题收集、讨论和文献总结,形成了这一共识。共识强度由推荐级别和证据级别组成。推荐等级:一级(应执行),已被证明和/或一致认可有效;第二类(实施适当),相关证据和/或意见趋于有效;ii类(可考虑),相关证据和/或意见不能充分说明和有效;第三类(无益或有害),已被证明和/或一致认为无效,在某些情况下可能有害,不建议使用。

3号

共识的主题内容。

这一共识分为五个部分,包括实验室环境设置、降低供精者病原微生物感染风险、保证冷冻精液样本质量、保证冷冻精液样本储存安全以及加强精子使用的随访等。,共提出了16条建议,从而为人类冷冻精液的质量安全提供了保障。

一个

实验室环境设置。

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人类精子库实验室的清洁度设置。

实验室环境和空气质量是影响辅助生殖技术效果的关键因素之一。空气质量下降会对胚胎发育潜能和ART技术产生负面影响,导致受精率、临床妊娠率、活产率等关键指标下降。人类精子库实验室是处理冷冻精液的核心区域,其环境的安全性对后续的精子捐献ART有重要影响。

目前,人类精子库实验室的环境设置没有统一的标准。建议参照胚胎实验室精子处理室、冷冻室的设置,按照GB50073-2013国家标准设置为万级层流实验室。层流实验室中每立方米空气中小于一定直径的颗粒数量如表1所示。实验室应采用正压通风,即出风速度快于进风速度。为了保证实验室的环境安全,路线要合理规划。比如工作人员要先去更衣室,穿上无菌衣、帽、鞋,然后洗手、戴口罩,再通过缓冲区(有条件的实验室可以安装空气淋浴系统,去除灰尘和静电),然后进入实验室。为了保证实验室的空气质量,减少外源性污染,传递精液样本的唯一途径应该是传递窗口。

共识:建议将人类精子库实验室的洁净度设置为万级层流实验室(推荐等级:IIa类)。

人类精子库实验室生物安全标准的制定。

精液是人类精子库实验室最常见的标本,其中可能含有传染性病原微生物。根据WHO《实验室生物安全手册》第三版,根据其相对危害程度,可对人或动物造成疾病,但不易造成严重危害,其危害程度评定为二级。根据风险等级,建议精液在具有二级生物安全等级的实验室进行检测和冷冻。

二级生物安全实验室的运行及设施设备要求见表2。实验室门口应设置国际生物安全危险警告标志。所有进入实验室的人员都应得到批准和适当保护。实验室应按照操作规范进行实验操作,并有相关的标准操作规程。每个实验室应配备生物安全柜/洁净工作台,并根据实际情况和设备设施制定适用于实验室的标准操作规程和生物安全检查表,包括实验室技术人员的健康管理、自我保护和安全培训、标准或特殊安全操作规程、实验设备安全消毒规程、生物废物处理等。应急处理程序、实验室设计、试剂和耗材管理、设备管理、废弃物处理、实验操作流程、生物安全柜/洁净工作台管理、实验室环境生物监测如空气培养、表面细菌培养、紫外线灯消毒监测等。

共识:建议人类精子库实验室生物安全标准设置参考二级生物安全标准(推荐等级:IIa类)。

实验室合理分区设置。

人类精子库的主要任务是:①筛选合格的供精者,为合格的辅助生殖医疗机构提供合格的冷冻精液;②为有保生育需求的客户提供生育保险。

人类精子库实验室处理的精液样本来源分为两类:供精者和自存精者。捐精者需要经过一系列病原微生物和传染病的检测,包括乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病、支原体、衣原体等。在正式捐献精子之前。自体精子保存者在精子库中冷冻保存自己的精液前,需要检测病原微生物和感染性疾病。如果病原微生物或传染病检测结果异常,人类精子库可在充分冷冻保存并告知使用风险后,提供自体精液保存服务。

由于自体精子保存者和精子捐献者的类别不同,致病微生物和传染病的风险也有很大差异。因此,建议人类精子库实验室对自存精子样本和供精者精子样本进行不同区域的处理,使用不同的控制台和生物安全柜/洁净工作台进行精液检测和冷冻处理。

处于筛查阶段的供精者未进行病原微生物和传染病筛查。与合格的捐精者相比,他们的精液样本有感染的风险。建议人类精子库实验室在不同地区对合格阶段的供精标本和筛选阶段的供精者进行处理,使用不同的控制台和生物安全柜/洁净工作台进行精液检测和冷冻处理。

共识:建议实验室合理设置分区:将自存精液标本与供精标本进行分区,合格阶段供精标本与筛查阶段供精标本进行分区(推荐等级:一级)。

2

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降低捐精者病原微生物感染的风险。

供精完成时间及传染病检测。

合格的供精者需要多次到人类精子库进行精子采集,每次采集前禁欲2 ~ 7天,直至满足人类精子库冷冻精液储存需求。每个供精者的采集频率为4 ~ 7次,大多数供精者在2 ~ 3个月内即可完成供精过程。根据原卫生部2003年颁布的《人类精子库基本标准和技术规范》,捐精者每半年应检查一次,包括病史筛查、体格检查、遗传病检测、病原微生物和传染病检测等。为进一步降低供精过程中微生物感染的风险,建议供精者在3个月内完成供精。对于3个月以上未完成精子捐献的捐精者,建议再次检测传染病,包括但不限于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病。

共识:建议捐精者在3个月内完成精子捐献,超过3个月未完成精子捐献者建议再次进行传染病检测(推荐级别:IIb类)。

捐献者取精过程中微生物感染风险的预防和控制。

在采精过程中,有效清洁供精者的手和生殖器,可以降低精液中微生物感染的风险,减少杂菌造成的污染,其中消毒方法的选择尤为重要。理想的消毒剂应具有杀菌/抑菌谱广、作用迅速等基本特性,还应无毒无味、无刺激性。

目前临床上常用的消毒剂有碘复合消毒剂和一次性消毒湿巾。复合碘消毒剂主要成分为复合碘,具有强氧化性。它可以通过表面活性剂与细胞膜和细胞质结合,使微生物的蛋白质变性沉淀,使其失活,进而达到消毒的目的。

一次性消毒湿巾的主要成分是季铵盐类阳离子表面活性剂苄索氯铵,易被各种带负电的细菌吸附,进而具有杀菌的作用。与一次性湿巾相比,碘复合消毒剂不适用于捐精者外生殖器的消毒。碘伏消毒液有颜色,有轻微刺鼻气味,可能对外生殖器造成物理刺激,引起轻微疼痛和瘙痒。另外,碘伏消毒液使用的是碘伏棉球,沾有大量碘伏液。消毒时容易残留在外生殖器,手淫和取精时可能混入精液,进而影响精子活力。

一次性消毒湿巾不仅消毒杀菌效果好,而且刺激性低,操作方便。同时湿巾性能稳定,不易残留,可有效避免消毒剂成分对精液质量的影响。捐精者对一次性湿巾的接受度也明显高于碘伏消毒液。因此,建议捐精者使用一次性取精产品,包括一次性垫、一次性无菌湿巾、一次性无菌广口取精杯等,避免取精过程中精液被微生物感染。取精室应及时消毒,防止供精人员交叉污染。在捐精者采集精液前,人类精子库的工作人员要对其进行好手和外生殖器清洁流程的教育,包括讲解、视频教育、图文教育等方式,让捐精者充分认识到有效清洁的重要性,督促捐精者按流程操作,认真完成消毒流程。

共识:建议供精者使用一次性取精产品,加强有效消毒教育,预防供精者取精过程中微生物感染风险(推荐等级:IIa类)。

冷冻精液的细菌培养。

细菌感染是精液微生物感染的常见原因。精液中的细菌感染可直接或间接影响精子功能,如精液液化时间、精子活力和存活率等,可严重影响精子质量和生精功能。精液中的微生物不利于精子与透明带的结合,会降低精子的受精能力。精液中的细菌污染也可能导致胚胎污染,影响抗逆转录病毒治疗的结果。细菌培养是保证冷冻精液质量的重要指标之一。建议每批供精者冷冻精液都要进行培养,以消除致病菌。

精液中常见的致病菌有阴道加德纳菌、B链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等。经培养鉴定为致病菌的冷冻精液样本必须销毁。

共识:建议对每批供精者的冷冻精液进行细菌培养,培养鉴定出致病菌的冷冻精液标本必须销毁(推荐等级:一级)。

人类精子库中冷冻保护剂的选择和应用。

冷冻保护剂在精子冷冻过程中起关键作用,减少精子中冰晶的形成,减缓细胞收缩,从而维持细胞膜的稳定性,减少精子冷冻损伤。

常用的防冻剂分为渗透性防冻剂和非渗透性防冻剂。不透性冷冻保护剂的常见成分是蛋黄,在精子冷冻过程中可以保持精子细胞膜的稳定性,使细胞内的水分快速渗出,从而减少冰晶的形成。蛋黄中的低密度脂蛋白可以在精子膜上形成一层保护膜,保护精子顶体膜在冷冻过程中不受损伤,进而达到更好的冷冻保护效果。因此,含蛋黄的冷冻保护剂(TYB)被广泛用于精子冷冻。

但蛋黄是外源性生物活性物质,其灭活处理和使用存在一定的安全隐患。含卵黄冷冻保护剂的精液细菌污染比例较高。随着对冷冻保护剂的深入研究,学者们发现其他不含蛋黄的冷冻保护剂,如甘油型、含L-磷脂酰胆碱(PC)和L-乙酰肉碱(ANTIOX-PC)的冷冻保护剂,在没有外源性生物安全风险的情况下,也能达到同样的冷冻保护效果。

因此,建议在人类精子库中使用不含卵黄的商业冷冻保护剂,以保证冷冻精液样本的安全性。

共识:建议人类精子库使用不含蛋黄的商业冷冻保护剂(推荐水平:IIa类)。

保证冷冻精液标本的质量。

精液液化后检测、分装、冷冻的时间管理。

精液取出后,在室温下几分钟内开始液化。一般试样在15分钟内完全液化,液化时间很少超过60分钟。为了保证检测和冷冻的质量,应严格控制精液采集和分析之间的时间间隔。

从附睾排出的精子,除精子外,还含有大量的死精子和细胞成分。分离细胞的脂质分解产物携带自由基从细胞中溢出,进而损害精子和其他细胞。精液取出后,随着保存时间的延长,由于脱水、酸碱度、渗透压和温度的变化,精子活力可能会降低。随着精液在体外保存时间的延长,维持精子供能的精果糖浓度随着精子本身的运动而越来越低,导致精子活力下降。因此,精液取出后尽快冷冻有助于提高冷冻复苏率。精子在体外储存时间过长,会导致精液中活性氧产生过多,破坏精子膜的流动性和完整性,造成DNA损伤。精子长期孵化产生的有害物质也可能影响胚胎的潜在发育,进而影响ART的妊娠结局。

建议冷冻精液样本前尽量减少体外操作时间,建议在一小时内完成精液分装并开始冷冻过程。

共识:建议精液取出液化后开始检测,完成分装,一小时内开始冷冻(推荐级别:IIa)。

冷冻精液标本的质量抽查管理。

由于冷冻过程中冰晶的形成和渗透压的变化等因素,精子损伤是不可避免的。精子库应选择合适的冷冻保护剂和冷冻方法,尽量减少冷冻损伤。研究发现,冷冻保存后,精子浓度、回收率和DNA损伤不会随冷冻保存时间的延长而发生明显变化,冷冻精液标本的临床妊娠率、流产率和活产率与精子冷冻保存时间的长短无明显相关性,但冷冻保存5年以上,精子活力会明显下降。

采集合格的供精者后,其冷冻精液样本应保存在液氮中,经过6个月的检疫后,再进行HIV复检后才能给予外用。同一供精者的冷冻精液样本只能使5名妇女怀孕。在第一个外部供体之后,人类精子库需要等待受体结果的反馈信息,然后以递减的方式进行分配。因此,供精者的冷冻精液样本需要长期保存在液氮罐中。但在人类精子库的日常管理中,频繁的入库、移库等操作导致冷冻精液标本反复短期暴露于室温,可能会影响冷冻保存中的冷冻精液标本。为了保证冷冻精液样本的质量,建议人类精子库每年至少随机检查一次冷冻精液样本的质量。

共识:建议每年至少随机检查一次冷冻精液样本质量(推荐级别:IIb类)。

关于与生殖中心对接的冷冻精液标本的使用。

捐精合格的冷冻精液样本由精子库提供给有资质的辅助生殖医疗机构。为保证最佳使用效果,精子库应为合作辅助生殖医疗机构冷冻精液标本的回收提供协助,包括提供常规、规范的回收程序,为不同质量的供精和自体精子保存提供冷冻精液的回收操作规程,统一冷冻回收后的精子评价方法。

共识:建议为合作生殖中心提供常规、规范的供精冷冻精液标本回收程序,不同质量的自身精子保存的冷冻精液回收程序,冷冻回收后统一的精子评价方法(推荐等级:IIb类)。

冷冻精液标本储存的安全管理。

冷冻精液样本在-196℃液氮中冷冻保存,可达到良好的冷冻效果。现有证据表明,大多数传染性物质,如艾滋病病毒、HBV病毒和细菌,可以在液氮中存活,并通过液氮作为传播媒介感染其他标本,导致冷冻精液标本之间的交叉污染。为防止交叉污染,确保冷冻精液样本的储存安全,提出以下四点建议。

自体精子保存标本和供精标本的保存。

自体精子保存标本在来源上不同于供体标本。经过系统的体格检查、精液检查以及筛查阶段的传染病和病原微生物检测,供体感染风险远低于自身精子保存标本。自体精子标本和供体标本在辅助生殖中有完全不同的用途。精子库向辅助生殖机构提供合格供体的冷冻精子标本,以帮助不育夫妇,而自体精子保存标本则提供给辅助生殖机构,仅供自体精子保存者的合法妻子使用。因此,建议将自体精子标本和供体标本保存在不同的液氮罐中。同时,建议如果有两个或两个以上的自净标本,至少分两批放入不同的自净液氮罐中,防止不可预知的损失。

共识:建议将自体精子保存标本和供精标本存放在不同的液氮罐中(推荐级别:一级)。

供体冷冻精液样本的分级储存。

采集捐献者精子样本后,经过6个月的隔离期后,可对HIV等符合条件的候选人进行复检,再将外部捐献者提供给辅助生殖机构。HIV复检是捐献者冷冻精液标本合格的关键时间点。此前,捐献者的冷冻精液标本未经检疫仍有感染艾滋病病毒的风险。因此,建议将HIV复检前后捐献者的冷冻精液样本分别保存在不同的液氮罐中。

液氮蒸气罐采用气相液氮进行冷冻保存,精液样本不会与液氮直接接触,可以降低液氮成为交叉污染传播介质的风险。使用液氮蒸气罐已经成为减少微生物交叉污染的一种相对安全的储存方法。建议合格的精子库自身精子样本和供精者样本可以保存在液氮蒸汽罐中,但液氮蒸汽罐不能代替供精者的冷冻精子样本分阶段保存在罐中。

共识:建议捐献者冷冻精液样本分阶段存放在不同的液氮罐中(推荐级别:一级)。

冷冻精液样本冷冻保存载体的选择。

浸入未密封的载体中,液氮被载体中的样品污染,被污染的液氮作为传输介质污染其他样品。精子冷冻保存前,自体精子保存者会常规检测传染病和病原微生物,冷冻保存前结果为阴性。但有些特殊的客户,如放化疗前的癌症患者或其他特殊情况,时间不够,需要立即冷冻。部分自精子保存者在冷冻前传染病和病原微生物检测呈阳性,在人类精子库做了充分的后续冷冻保存并告知使用风险后,自精子保存者仍坚持/需要冷冻保存,可提供自体精液保存服务。而且自体精液的保存者一般冷冻6个月后没有HIV复查,不能排除感染的风险。

因此,自精子保存器的冷冻精液标本存在较高的感染风险,强烈建议使用密封载体进行冷冻精液标本的自精子保存,可有效避免冷冻精液标本之间的交叉感染。

共识:建议冷冻保存的精液标本使用密封载体(推荐水平:IIa)。

液氮储罐温度和液位的监控与管理。

保障液氮罐的安全是人类精子库的重要任务之一。传统的人工巡检有漏检的可能,节假日和夜间无法监控。强烈建议人类精子库使用液氮监测系统监测每个液氮罐的温度和液位,并定期进行人工复检,保存相关记录。液氮监测系统应具有自动报警功能。当液氮罐液位突然下降,温度低于阈值时,会自动报警,通知工作人员及时处理。同时,储存液氮罐的房间应设置氧气浓度监测,防止工作人员在短时间内因房间缺氧而受到伤害。

液氮储罐的使用寿命通常应在其质量保证期内,有些厂家的真空度保证期仅为3 ~ 5年。随着使用寿命的增加,液氮储罐的安全性也在下降。人类精子库要做好液氮罐的管理,至少准备一个能正常使用且不低于单罐最大储存量的备用罐,以备发生意外时进行标本转移。

共识:建议使用液氮监测系统监测液氮罐的温度和液位(建议液位:一级)。

加强供精反馈和使用随访。

停止供精者冷冻精液样本对外供应的标准。

供精ART是治疗男性无精子症和严重少弱精子症的有效方法。2017年,我国17870个供体人工授精(AID)周期的临床妊娠率为26.46%,远高于同年13.73%的临床妊娠率。试管婴儿周期的临床妊娠率为60.47%,远高于其他周期(53.45%)。根据原卫生部176号文件《人类辅助生殖技术规范》的相关规定,人工授精的临床妊娠率不低于15%,体外受精的受精率不低于65%。当外供者冷冻精液未孕8个AID周期(非同一受体)或供者精子2个IVF周期未受精且排除明显的雌卵因素时,供者精子临床妊娠率远低于报道水平及相关规定,有可能考虑精子相关因素,因此建议停用外供者精子。

共识:建议供外冻精不要受孕8个AID周期,或供精2个IVF周期不受精,排除明显的雌卵因素,停止供本志愿者冷冻精液标本的外供(推荐水平:IIb类)。

体外冷冻精液样本出生缺陷和后代遗传风险的评估和治疗。

出生缺陷是指胚胎发育异常引起的形态、结构、功能、代谢和精神行为的异常,包括先天性畸形、智力低下和代谢性疾病。根据原卫生部2012年发布的《中国出生缺陷防治报告(2012)》,中国出生缺陷总发生率为5.6%。我国报道的供精后代出生缺陷发生率为0.3% ~ 1.56%,比例较低,供精后代与夫精后代出生缺陷发生率无显著差异。这些研究表明使用抗逆转录病毒疗法是安全有效的。

所有外部供精者均经过精液质量、感染性疾病、传染性病原微生物和遗传性疾病筛查,可有效降低精子来源对后代出生缺陷的不良影响。但影响出生缺陷发生的因素很多,除了20% ~ 25%是染色体异常或单基因缺陷所致外,大部分是未知的,可能同时受到遗传因素和环境因素的影响。因此,人类精子库对捐精者的有限遗传筛查并不能完全杜绝后代出生缺陷的发生。

建议当人类精子库外供应的冷冻精液样本后代存在出生缺陷时,应根据出生缺陷的具体类型,与遗传专家共同进行遗传风险评估。如果遗传风险高,应立即停止外部供应,并通知外部供应的冷冻精液样本停止使用。

共识:如果外供冷冻精液样本后代存在出生缺陷,应进行遗传风险评估,遗传风险高,应停止外供(推荐水平:IIb类)。

4号

摘要

保证冷冻精液的质量和安全是人类精子库的一项重要任务。从建立实验室环境、降低供精者病原微生物感染风险、保证冷冻精液标本质量、保证冷冻精液标本保存安全、加强精子使用随访5个方面提出建议,从而形成可供人类精子库参考的专家共识,为保障我国供精者冷冻精液质量、建立统一的人类精子库操作标准提供帮助。

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